吸光度測量基礎知識

紫外-可見光吸光度測量長期以來一直是生命科學實驗室中定量純化生物分子的標準方法。該方法允許根據分子在特定波長下的吸光度曲線快速檢測分子。

吸光度還提供樣品污染的指示。吸光度光譜的形狀將根據其他分子的存在而變化，這些分子的吸收波長與目標分子相同或接近相同波長。

熒光定量基礎知識

熒光團是吸收一個波長（激發波長）的光并發射另一個波長（發射波長）的光的分子。某些熒光團的結構只有在與特定分子（例如雙鏈 DNA）結合時才能發出熒光。熒光檢測利用這種結合特異性來建立樣品發射的熒光量與溶液中目標生物分子濃度之間的直接關聯。

通過將熒光基團與已知濃度的樣品混合并測量相對熒光單位 （RFU），可以繪制濃度與測得的 RFU 之間的關系，并將其用作標準曲線。然后可以將與未知樣品結合的相同熒光團的發射光與該標準曲線作圖，以確定樣品濃度。

比較吸光度和熒光結果

在比較基于吸光度的方法和基于熒光的方法的結果時，重要的是要考慮每種方法的特異性。例如，在 260 nm 處的吸光度測量對 dsDNA 沒有選擇性，因為 ssDNA 和 RNA 也在 260 nm 處吸收。在 260 nm 處的任何吸光度測量都是對樣品中所有核酸和存在的任何污染物（包括蛋白質）的測量。這適用于所有類型的測量，而不僅僅是核酸。因此，吸光度法非常適合測量純樣品。

相比之下，熒光檢測對給定的分析物具有高度特異性，包括但不限于 dsDNA、ssDNA、RNA 或蛋白質。通常，通過吸光度測量的樣品濃度大于通過熒光方法測量的濃度。